人体细胞中蛋白质组的大约1/3是分泌蛋白和膜蛋白，包括许多细胞因子、抗体、膜通道和膜受体等。这些蛋白质往往富含二硫键，即肽链上两个半胱氨酸残基侧链的巯基被氧化形成的共价键。形成正确的二硫键对这些蛋白质的结构稳定性和功能完整性十分重要。含有二硫键蛋白质的折叠过程被称为蛋白质的氧化折叠，氧化折叠是最复杂的蛋白质折叠问题。随着半胱氨酸和二硫键数目的增多，可能的配对方式将呈现指数级增长（图1）。在众多可能的二硫键配对形式中，天然态蛋白质只具有其中的一种或有限的几种形式。对许多特化的分泌细胞来说，蛋白质氧化折叠的压力是难以想象的。例如，单个浆细胞每秒可以合成数千个IgM五聚体，这需要每秒形成约105个二硫键；一个胰岛β细胞每分钟可以产生大约100万个胰岛素分子，约300万个二硫键。因此，如何高效正确地实现蛋白质氧化折叠对细胞来说是一个巨大的挑战。
图1.蛋白质氧化折叠问题[1]
随着二硫键数目p的增加，蛋白质分子可能形成的二硫键异构体数目i呈指数级增长。
二、从诺贝尔奖到胰岛素合成--蛋白质氧化折叠的早期研究
最早的蛋白质氧化折叠研究可追溯到二十世纪五六十年代。美国国立卫生研究院的ChristianB．Anfinsen根据还原变性的牛胰核糖核酸酶A在去除变性剂和还原剂后，依靠空气氧化就能够自发地形成正确的4个二硫键，重新折叠成天然的三维结构并恢复几乎全部生物活性的实验，提出“多肽链的氨基酸序列包含了形成其热力学上稳定的天然构象所必需的全部信息”，也就是常说的“蛋白质一级结构决定高级结构”的著名论断[2]。Anfinsen因此获得1972年诺贝尔化学奖，开辟了近代蛋白质折叠的研究领域。几乎是同时，1958年，中国决定启动牛胰岛素人工合成工作。胰岛素是由A链和B链两条肽链通过2个链间二硫键连接起来的蛋白质分子，其中A链还含有1个链内二硫键。邹承鲁先生领导的小组在人工全合成工作中首先解决了胰岛素A、B链二硫键拆合问题，为确定合成路线奠定了坚实的基础，并提出了“天然胰岛素的结构是所有AB异构物中最稳定的结构之一”的重要结论[3]。这无疑是对蛋白质氧化折叠乃至蛋白质折叠问题的重大贡献。
然而，上述研究多是在体外较低的蛋白质浓度和较温和的氧化条件下实现的，一旦蛋白质浓度提高复性产率就会大大下降。另一方面，形成二硫键的反应速度是相对较慢的，这样的速度不能满足机体生命活动的进行。1963年，Anfinsen和匈牙利科学家BrunóF.Straub（后来成为匈牙利国家主席）分别从大鼠肝脏微粒体和鸽子胰脏提取物中找到一种能够有效促进底物蛋白质氧化折叠的物质[4-5]，即蛋白质二硫键异构酶（proteindisulfideisomerase,PDI）。20世纪70年代末改革开放初期，“科学的春天”来到，邹承鲁先生重拾胰岛素研究，谓“老题新做”，即胰岛素二硫键拆合成功的基础研究，在中国科学院生物物理所重新扬帆启航。王志珍老师作为其中一名重要的船员，最早成功地用PDI催化胰岛素的正确重组，提出“PDI既是酶又是分子伴侣”的假说[6]，并为此假说提供了实验支持，在国内开辟了分子伴侣和折叠酶研究的新方向。
三、Ero1--催化二硫键从头合成的氧化酶
现在我们知道，蛋白质氧化折叠主要发生在真核细胞的内质网（endoplasmicreticulum,ER）和原核细胞的周质腔（periplasm）中。内质网拥有一整套包括折叠酶和分子伴侣在内的“质量控制”系统为蛋白质氧化折叠提供了保障。就好像北京的地铁，每天要运送超过1000万的乘客，不仅有志愿者作为“分子伴侣”维持秩序，还有安检员负责处理“坏分子”。这样，地铁里的乘客们就能够被纵横交错的地铁网络（很像内质网管状网络）有条不紊地运输到各自的目的地。此外，内质网的谷胱甘肽还原电位（EGSH）约为–200mV，远高于胞浆中的–300mV。内质网腔偏氧化的环境也有利于二硫键形成。
图2Ero1氧化酶的功能和结构[11]
（A）Ero1通过柔性环（天蓝色）上的外部活性中心（黄色圆点），内部活性中心（橙色圆点）以及FAD辅基（橙色六边形）之间的“接力”，将氧化力从O2传递到PDI进而促进底物氧化折叠。Ero1的活力还受到调控二硫键（连接蓝色和黄色圆点）“开关”的负反馈调节。（B）用AlphaFold预测的酵母、人和拟南芥的Ero1的三维结构。在人Ero1α中，红色和紫色小球代表磷酸化和亚硝基化位点，其余元素和（A）图一致。
四、PDI--负责任的二硫键"搬运工"
典型的PDI由4个硫氧还蛋白（Trx）结构域a，b，b'，a'以及一段b'和a'之间的x连接区组成，其中a和a'结构域各含有1个-CGHC-活性中心，负责催化二硫键的氧化、还原和异构反应。2013年，王志珍和冯巍课题组合作研究解析了人源PDI的晶体结构，4个Trx结构域呈“U”形排列（图3A），揭示了PDI的构象还能被其活性中心的氧化还原状态所调节。氧化还原偶联的PDI构象变化使得“U”形结构能在“开放”和“关闭”之间动态切换，有利于PDI结合和释放不同形状、大小和折叠状态的底物。我们近期的工作还表明，在内质网应激条件下PDI分子x连接区一个关键的丝氨酸残基可以被Fam20C磷酸化，使得PDI从“U”形结构转变为更加开放的“L”形，实现PDI从“折叠酶”到“分子伴侣”的功能转换[12]。这一工作揭示了PDI是一种新的应激激活的分子伴侣，极大地丰富了“PDI既是酶又是分子伴侣”的科学论断。
为了应对人蛋白质组中二硫键的高复杂度，PDI必须具备同时行使催化二硫键氧化和异构的能力。有意思的是，人Ero1α以剂量依赖的方式加速底物二硫键的氧化速率，但几乎不影响PDI的异构酶活性。这是由于Ero1α偏好氧化PDI的a'结构域活性中心，但几乎不氧化a结构域，使后者保持发挥异构酶活力。这样一个精妙的机制，使得PDI能够“一手画圆，一手画方”，从而保证蛋白质氧化折叠的高效性和保真性。基于生物化学和结构生物学数据的分子对接模型进一步证实了这一观点（图3B）。
图3PDI及其和Ero1α复合物的结构[11]
（A）用AlphaFold预测的酵母、人和拟南芥的典型PDI的三维结构，黄色小球代表活性中心。（B）基于生物化学和结构生物学数据的分子对接模型显示，Ero1α的外部活性中心接近PDI的a'结构域活性中心。
五、蛋白质氧化折叠与人类健康
六、总结与展望
在过去的十多年里，我们对内质网特有的酶系统如何维持蛋白质氧化折叠的效率和保真性有了更深刻的理解。Ero1-PDI氧化折叠机制已经在酵母、植物和哺乳动物中被揭示。作为一种内质网的主要氧化酶，Ero1决定了内质网较为氧化的环境，其活性和功能可被自身“调控环”上发生的各种翻译后修饰精确控制。在高等真核生物中，丰富的PDI家族成员在蛋白质氧化折叠过程中表现出分工不同又互相协同，以保证二硫键形成的高效性和保真性（图4）。
图4Ero1α-PDI维持人细胞内质网中蛋白氧化折叠保真性和氧化还原稳态[11]
七、致谢
感谢中国科学院生物物理研究所王志珍院士和王曦副研究员对本文提出的宝贵修改意见。
参考文献
1.BorgesCR,LakeDF.Oxidativeproteinfolding:nature'sknottychallenge.AntioxidRedoxSignal,2014,21(3):392-395
2.HaberE,AnfinsenCB.Regenerationofenzymeactivitybyairoxidationofreducedsubtilisin-modifiedribonuclease.JBiolChem,1961.236:422-424
3.杜雨苍,张友尚,鲁子贤,等.从胰岛素A及B链重合成胰岛素.ActaBiochimicaetBiophysicaSinica,1961(1):13-25
4.GoldbergerRF,EpsteinCJ,AnfinsenCB.Accelerationofreactivationofreducedbovinepancreaticribonucleasebyamicrosomalsystemfromratliver.JBiolChem,1963，238:628-635
5.VenetianerP,StraubFB.Theenzymicreactivationofreducedribonuclease.BiochimBiophysActa,1963.67:166-168
6.WangCC,TsouCL.Proteindisulfideisomeraseisbothanenzymeandachaperone.FASEBJ,1993,7(15):1515-1517
7.FrandAR,KaiserCA.TheERO1geneofyeastisrequiredforoxidationofproteindithiolsintheendoplasmicreticulum.MolCell,1998,1(2):161-170
8.PollardMG,TraversKJ,WeissmanJS.Ero1p:anovelandubiquitousproteinwithanessentialroleinoxidativeproteinfoldingintheendoplasmicreticulum.MolCell,1998,1(2):171-182
9.WangL,LiSJ,SidhuA,etal.ReconstitutionofhumanEro1-Lalpha/protein-disulfideisomeraseoxidativefoldingpathwayinvitro.Position-dependentdifferencesinrolebetweentheaanda'domainsofprotein-disulfideisomerase.JBiolChem,2009,284(1):199-206
10.ZhangJ,ZhuQ,WangX,etal.SecretorykinaseFam20CtunesendoplasmicreticulumredoxstateviaphosphorylationofEro1alpha.EMBOJ,2018,37(14):e98699
11.WangL,WangCC.Oxidativeproteinfoldingfidelityandredoxtasisintheendoplasmicreticulum.TrendsBiochemSci,2022,doi:10.1016/j.tibs.2022.06.011
12.YuJ,LiT,LiuY,etal.PhosphorylationswitchesproteindisulfideisomeraseactivitytomaintainproteostasisandattenuateERstress.EMBOJ,2020,39(10):e103841
13.ZhangY,LiT,ZhangL,etal.Targetingthefunctionalinterplaybetweenendoplasmicreticulumoxidoreductin-1alphaandproteindisulfideisomerasesuppressestheprogressionofcervicalcancer.EBioMedicine,2019,41:408-419
14.WangL,WangX,LvX,etal.TheextracellularEro1alpha/PDIelectrontransportsystemregulatesplateletfunctionbyincreasingglutathionereductionpotential.RedoxBiol,2022,50:102244
15.LiuP,WangX,SunY,etal.SARS-CoV-2ORF8reshapestheERthroughformingmixeddisulfideswithERoxidoreductases.RedoxBiol,2022,54:102388
作者简介
王磊，中国科学院院生物物理研究所研究员，中国生物物理学会亚细胞结构与功能分会副秘书长。国家优秀青年科学基金获得者，中科院青年创新促进会优秀会员。
研究方向：内质网稳态维持的分子机制及其在人类健康中的作用。
探索蛋白质奥秘，
致力全人类健康。
——作者科普寄语
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原标题：《【前沿科普】蛋白质氧化折叠：过去、现在和未来》